酪酰胺信號(hào)放大

該酪酰胺信號(hào)放大 (TSA) 方案可用于通過免疫染色或 原位雜交檢測過氧化物酶標(biāo)記樣品中的信號(hào)。所有孵育均在搖床上進(jìn)行。

試劑：

• 2-4% 甲醛，pH 7.4

• 磷酸鹽緩沖液 (PBS)，pH 7.4

• PBT：0.1% Tween-20； PBS，pH 7.4

• 1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液

• 30 % H2O2

• 1 mg/ml熒光標(biāo)記酪酰胺，標(biāo)記 級(jí) DMSO

可選：

• 硫酸葡聚糖 (DS)

• 4-碘苯酚

• 酸性甘氨酸緩沖液：0.1 M 甘氨酸； pH 2.0； 0.1% 吐溫-20

協(xié)議：

1. 按要求的方式固定樣品。通常，用冷的 2-4% 甲醛（pH 7.4）進(jìn)行固定。用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）和PBT （0.1% Tween-20；PBS，pH 7.4）清洗固定劑中的樣品。

2. 通過將樣品在 抑制溶液（PBT 中的 1 mM 疊氮*鈉）中室溫孵育 30-60 分鐘來抑制內(nèi)源過氧化物酶活性。

可選?？梢允褂?PBT 中的 3% H 2 O 2或 0.02 N HCl代替 1 mM 疊氮*鈉進(jìn)行抑制。對(duì)于后續(xù)的免疫化學(xué)，該階段可以與阻斷抗體的非特異性結(jié)合相結(jié)合。為此，必須將封閉血清或 1% BSA 添加到疊氮化物或 H 2 O 2 溶液中。

筆記！如果背景較低且進(jìn)行原位雜交，則可以跳過此步驟；直接進(jìn)入步驟4。

3. 在室溫下，在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分鐘，從抑制溶液中清洗樣品。

4. 執(zhí)行所有免疫化學(xué)或 原位雜交步驟，用過氧化物酶偶聯(lián)抗體標(biāo)記樣品。

5. 室溫下在 PBT 中孵育 3 次，每次 10 分鐘，清洗樣品以去除抗體。

6. 使用前立即制備反應(yīng)緩沖液。為此，用 30% H 2 O 2將 PBT 稀釋兩次，每次 1:100，直至最終濃度為 0.003% (1:10000)。

可選。為了提高方法的靈敏度，可以將以下組分添加到反應(yīng)混合物中（單獨(dú)或組合）：

• 2% 硫酸葡聚糖 (DS) 用于增加反應(yīng)混合物的粘度。

• 500 µg/ml 4-碘苯酚用于增強(qiáng)過氧化物酶反應(yīng)。以 1:200 稀釋儲(chǔ)備液（100 mg/ml 乙醇溶液）使用更方便。

7. 將 1 至 10 μg/ml標(biāo)記的酪酰胺添加到反應(yīng)緩沖液中（最佳濃度必須通過實(shí)驗(yàn)確定）。通過搖動(dòng)混合。

8. 將樣品與反應(yīng)緩沖液在黑暗中室溫孵育 5-30 分鐘（確切時(shí)間通過實(shí)驗(yàn)確定；可以以 15 分鐘為起點(diǎn)）。

9. 將樣品在抑制劑溶液（1 mM 疊氮*鈉的 PBT 溶液）中在室溫下避光孵育 10 分鐘來終止反應(yīng)。

10. 用 PBS 清洗樣品 3 次，每次 10 分鐘。

11. 要重復(fù)抗體-TSA 標(biāo)記周期，請在室溫下用酸性甘氨酸緩沖液（0.1% Tween-20；0.1 M 甘氨酸，pH 2.0）處理樣品 10 分鐘。該過程分離抗原結(jié)合的抗體，而不影響與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的酪酰胺。

12. 使用封固劑將樣品封固在蓋玻片下 。