檢測(cè)的每個(gè)組成部分包括一抗和二抗、封閉劑、緩沖液、酶綴合物和底物，可以對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，以提高新開發(fā)的ELISA工作方案的性能。測(cè)試了不同濃度和時(shí)間的包被、封閉、樣品培養(yǎng)和檢測(cè)步驟，以找到檢測(cè)的最佳條件。通常，一次測(cè)試一種成分，然而在某些情況下，可以通過應(yīng)用棋盤滴定網(wǎng)格方法同時(shí)優(yōu)化兩種成分，如下所示:

圖2:棋盤滴定網(wǎng)格法同時(shí)優(yōu)化兩種ELISA成分。本例顯示了組件A與組件B的對(duì)比，所有其他組件保持不變。

優(yōu)化涂層過程

可以在包被緩沖液中制備不同濃度的包被劑（靶抗原或捕獲抗體），并且可以應(yīng)用等體積的每種濃度來執(zhí)行ELISA方案，以發(fā)現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)對(duì)低背景的趨勢(shì)。在某些情況下，根據(jù)涂布劑的性質(zhì)，可能還需要優(yōu)化涂布緩沖液和平板涂布時(shí)間的選擇。

優(yōu)化阻塞過程

可以使用ELISA方案測(cè)試相同體積的不同制備的或市售的封閉溶液，以確保非特異性結(jié)合最少，而不會(huì)影響檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。如果封閉溶液是內(nèi)部制備的，可以調(diào)節(jié)不同濃度的封閉劑。

優(yōu)化樣品濃度

用于樣品制備以生成校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑應(yīng)盡可能模擬天然樣品基質(zhì)并測(cè)試不同的成分。用ELISA方案測(cè)試相同體積的連續(xù)稀釋樣品濃度。可以確定樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和稀釋線性的良好動(dòng)態(tài)范圍。樣品稀釋劑可能需要根據(jù)動(dòng)態(tài)范圍的光譜進(jìn)行調(diào)整。

優(yōu)化檢測(cè)過程

在標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中制備的不同濃度的檢測(cè)抗體可以用ELISA方案進(jìn)行等體積測(cè)試，以找到適合強(qiáng)信號(hào)和低背景噪聲的濃度。

辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶是ELISA中常用的兩種報(bào)告酶。在標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑中制備的不同濃度的酶綴合物或酶綴合的二抗通過測(cè)試板中每種濃度的等體積并進(jìn)行ELISA方案進(jìn)行優(yōu)化。可以確定產(chǎn)生具有最小背景噪聲的強(qiáng)信號(hào)的濃度。底物需要對(duì)在動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)清晰檢測(cè)的靶抗原敏感，并且能夠用合適的儀器檢測(cè)。

下表列出了包被和檢測(cè)抗體及酶偶聯(lián)物的推薦濃度范圍，可用于確定比色ELISA優(yōu)化的最合適實(shí)驗(yàn)條件。對(duì)于酶綴合物，查看制造商的說明書以了解更具體的濃度范圍。可以使用未純化的抗體，但可能需要比純化抗體更高的濃度，并可能導(dǎo)致更高的背景噪聲。建議使用親和純化的抗體以獲得最佳信噪比。建議的濃度范圍僅供參考；每個(gè)組件的單獨(dú)優(yōu)化將提供更好的結(jié)果。

表2:包被和檢測(cè)抗體和酶綴合物的推薦濃度范圍